ANTIOXIDANT PROPERTIES AND ANTI-DIABETIC EFFICACY OF A POLYHERBAL FORMULATION ADVOCATED IN THE SOUTHWEST OF ALGERIA FOR THE MANAGEMENT OF DIABETES: IN VITRO, IN VIVO, AND MOLECULAR DOCKING INVESTIGATIONS

INTRODUCTION

 Diabetes mellitus (DM), or commonly diabetes, represents a long-term hormonal and metabolic disorder marked by persistent hyperglycemia due to either impaired insulin production, peripheral tissue resistance, or both (ElSayed et al., 2023). Besides, these physiological changes are associated with alterations in protein and lipid metabolism in peripheral tissues (Stojkovic et al., 2019). Chronic hyperglycemia can result in several expensive and dangerous health problems affecting both smaller and larger vessels, some of which can be fatal (ElSayed et al., 2023). If untreated, diabetes can lead to several diseases and elevate the risk of severe microvascular complications, including diabetic retinopathy, nephropathy as well as macrovascular complications, such as heart failure, peripheral artery disease, and coronary heart disease (Tomic et al., 2022).

 DM is one of the significant health issues that has become a global epidemic in the twenty-first century (Standl et al., 2019). In this context, the global prevalence of DM has been rising rapidly in recent years, and more rapidly (80.63%, 474.7 million) in low- and middle-income countries than in high-income countries. Indeed, approximately 589 million adults had diabetes in 2024, or 11.1% of the world's adults, with future predictions indicating an elevation to 852 million by the year 2050 (IDF, 2025). Over 84 million individuals in the Middle East and North Africa Region (MENA) currently live with diabetes, accounting for approximately 17.6% of the adult population. In Algeria, the age-adjusted prevalence of diabetes among individuals aged 20 to 79 years was 17.5% in 2024, representing approximately 4.8 million adults living with diabetes (IDF, 2025).   Accumulating evidence has shown that oxidative stress serves as a significant trigger factor promoting the onset of several metabolic diseases, particularly DM and related complications (Chaudhary et al., 2023). Oxidative stress occurs due to higher reactive oxygen species (ROS) production, decreased endogenous antioxidant activity, or both. This imbalance may reduce the release of insulin from pancreatic beta cells and exacerbate insulin resistance in peripheral target tissues (Zhang et al., 2020). Hyperglycemia, a hallmark of diabetes, triggers ROS overproduction, worsening oxidative stress, and low-grade inflammation in adipose tissue (Hurrle and Hsu, 2017). Consequently, several irreversible emerging complications can be the onset of diabetes-related morbidity and mortality (Tomic et al., 2022).

 Several anti-diabetic drugs are available to manage diabetes or delay its complications (Dowarah and Singh, 2020). Nevertheless, most of them have many adverse side effects, including gastrointestinal disorders (nausea and vomiting), renal failure, body weight gain, and hypoglycemia (Chaudhury et al., 2017). But, there has been an increasing interest in polyherbal formulations (PHFs) for diabetes prevention and treatment due to their low side effects and toxicity (Suvarna et al., 2021). Moreover, plants are cost-effective and readily accessible (Anwar et al., 2022). PHF has been utilized in traditional medicine systems worldwide for thousands of years and is now gaining popularity in modern medicine due to its high efficacy in a wide range of diseases (Suvarna et al., 2021). Classically, a PHF combines multiple herbs used for therapeutic purposes (Palla et al., 2021). Furthermore, PHFs demonstrated better therapeutic effects than a single herb owing to synergistic pharmacological effects between the various active phytochemical compounds, resulting in significant potential for the treatment of diseases (Perumal et al., 2022).

 Numerous clinical and in vivo investigations are ongoing to assess the possible benefits of novel polyherbal formulations in the management of DM (Perumal et al., 2022; Khattak et al., 2024; Tanisha et al., 2024). Accordingly, this study sheds light on a twelve medicinal plants-made PHF used in folk medicine in the Adrar region, Algeria, to treat diabetes. We assessed the antioxidant activity of the polyphenol-rich infusion from this PHF. The anti-diabetic effects of polyherbal infusions and polyherbal-based diets on a streptozotocin rat model of diabetes mellitus were also investigated.

MATERIALS AND METHODS

Study location and period: This study was conducted from May 2022 to 2023. Plant materials were collected in May 2022, and all experimental investigations were performed at the Laboratory of Saharan Natural Resources, Faculty of Natural and Life Sciences, University of Adrar, Algeria.

Samples collection and preparation of polyherbal formulation: We made a twelve-herb-based polyherbal formulation (Table 1), belonging to different plant origins. Nigella sativa seeds, Ocimum basilicum aerial parts, Coriandrum sativum seeds, Lawsonia inermis leaves, Sorghum bicolor seeds, and Pennisetum glaucum seeds were harvested in the Adrar region (Southwestern Algeria) from May to October 2022. Artemisia herba-alba Asso aerial parts, Pimpinella anisum seeds, Ajuga iva aerial parts, Cuminum cyminum seeds, Juniperus phoenicea leaves, and Ammodaucus leucotrichus fruits were procured from herbalists.

 Before use, all plant materials were meticulously rinsed under running water and then thoroughly air-dried at ambient temperature. Each dried sample was weighed and then powdered using a coffee grinder. We stored each plant's powder at 4 °C in a sterile and airtight container until later experimental assays.

 The botanical composition of the PHF and the respective proportions of each plant component are presented in Table 1. The formulation was prepared by homogeneously blending the individually powdered plant materials in specific, non-uniform weights. As our study represents the first pharmacological investigation of this specific PHF advocated in local ethnomedicine for diabetes management, the weights used (Table 1) were determined based on authentic traditional prescriptions provided by local healers and ethnomedicine practitioners of the region. This approach is consistent with established ethnopharmacological methodology in African Traditional Medicine (ATM) and other traditional pharmacopeial systems, in which distinct plant ratios are traditionally employed to achieve synergistic therapeutic effects while minimizing potential toxicity (Hammiche and Maiza, 2006; Evans, 2009; Heinrich et al., 2018).

Preparation of polyherbal extract: The PHF aqueous extract was prepared using the traditional infusion method (Boudjelal et al., 2015). For this purpose, we used 80 mL of boiled distilled water to infuse 4 g of fine PHF powder. The mixture was stirred in a magnetic laboratory agitator for 15 minutes. Afterwards, the extracted solution was centrifuged at 4000 rpm for 20 minutes, followed by separation of the clear supernatant. Evaporation was performed using a rotary evaporator set at 40°C under reduced pressure. Then, the obtained dry extract was subsequently resolubilized in 10 mL of methanol for the subsequent colorimetric assessment of polyphenols and antioxidant capacity. The crude extract was stored in sterile, airtight containers at 4°C until subsequent use. The extraction yield percentage (%) was determined as follows (Ibidapo et al., 2019):

Table 1. Composition of the polyherbal formulation.

Qualitative Phytochemical analysis: The qualitative analysis of the PHF extract involves a standard series of tests to identify the presence or absence of different classes of bioactive compounds such as flavonoids, phenolic compounds, tannins, alkaloids, cardiac glycosides, reducing sugars, terpenoids, steroids, and saponins, based on the standard procedures (Harborne, 1998; Karumi, 2004; Ayoola et al., 2008).

Quantitative Phytochemical analysis: The quantitative phytochemical analysis involved the determination of total flavonoid content, total phenolic content and condensed tannins content. In the following tests, all tests were performed in triplicate, and the absorbance measurements were taken at 765 nm (TPC), 510 nm (TFC), and 500 nm (CTC) against a reagent blank (methanol for CTC), using a spectrophotometer (Agilent Technologies Cary 60 UV-Vis, USA) (Slinkard and Singleton, 1977).

Determination of Total Flavonoid Content (TFC): TFC was determined following the aluminum chloride (AlCl₃) procedure, as previously described (Sakanaka et al., 2005). Briefly, 1250 μL of distilled water was introduced into test tubes containing the PHF crude extract (250 μL), followed by the addition of a NaNO₂ solution (75 μL, 5%). Subsequently, 150 µL of aluminum chloride hexahydrate (AlCl₃•6H₂O, 10%) was introduced after 6 minutes of standing at room temperature, and the mixture was allowed to stand again for 6 minutes under the same conditions. Thereafter, the resulting mixture was mixed with 2 mL of NaOH solution (4%), followed by adjustment of the final volume to 5 mL with distilled water. Finally, all tubes were vigorously shaken and kept at room temperature for 15 minutes. TFC was calculated from the linear regression equation of the catechin standard curve prepared using the same procedure, and the results were reported as milligrams of catechin equivalent per 100 grams of dry weight (mg CE/g DW).

Determination of Total Phenolic Content (TPC): TPC was quantified according to the Folin-Ciocalteu procedure with slight modifications (Slinkard and Singleton, 1977). Briefly, in test tubes comprising 500 µL of the PHF aqueous extract, 2.5 mL of Folin-Ciocalteu reagent and 2 mL of 7.5% sodium carbonate solution were introduced. After that, all tubes were vigorously shaken and maintained in the dark at room temperature for 60 minutes. TPC was quantified from the standard calibration curve of gallic acid, and the results were reported as milligrams of gallic acid equivalent per 100 grams of dry weight (mg GAE/g DW).

Determination of Condensed Tannins Content (CTC): The quantification of CTC was performed using the vanillin method, as previously described (Salar and Purewal, 2017). The reaction mixtures were prepared as follows: 200 µL of the PHF extract was combined with 1500 µL of a methanol-vanillin solution (4%) and 750 µL of hydrochloric acid (37%). The resulting mixtures were allowed to stand at room temperature for 20 minutes of incubation. Then, the CTC was determined from the standard calibration curve of catechin, and the results were presented as milligrams of catechin equivalent per 100 grams of dry weight (mg CE /g DW).

In-vitro antioxidant activity: The antioxidant activities of the aqueous extract of the polyherbal mixture were estimated using three methods: DPPH antiradical activity, ABTS radical inhibitory capacity, and the FRAP test. All tests were performed in triplicates.

DPPH free radical scavenging capacity: The DPPH radical inhibitory action of the PHF aqueous extract was assessed using a standard procedure previously described (Bahiani et al., 2024). The DPPH radical inhibitory action of the test sample, as well as the standard reference antioxidants (ascorbic and gallic acids), was quantified as the % inhibition of the DPPH, which was calculated as follows:

 Where A₀ represents the absorbance of the DPPH solution, and A₁ is the absorbance of the standard references or test sample.

 The antiradical capacities were presented as an IC₅₀ (mg/mL) value, which denotes the sample concentration (mg/mL) required to scavenge 50% of the DPPH radical. Additionally, the reaction kinetics of the antioxidant activities were evaluated over 30 minutes, corresponding to the IC₅₀ value.

Ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay: The reducing ability of the PHF extract was evaluated following a procedure previously reported (Benzie and Strain, 1999). Three milliliters of FRAP solution was mixed with 40 µL of Trolox standard or PHF extract. Following a 30-minute standing at 37 °C, the absorbance measurements were taken at 593 nm. The reducing capacity was determined from the standard calibration curve of Trolox (100–1000 µM /mL), and the results were reported as µmol Trolox equivalent per 100 g dry weight (µmol TE/100 g DW).

ABTS radical scavenging activity: The ABTS radical scavenging activity was assessed using a standard procedure (Re et al., 1999). An amount of 3.9 mL of the freshly prepared ABTS solution was mixed with 100 µL of PHF extract or Trolox standard, followed by incubation for 6 min at room temperature. Afterward, the absorbance measurements were taken at 734 nm, and the scavenging ability was determined from the standard calibration curve of Trolox (100–1000 µM /mL). The findings were reported as micromoles of Trolox equivalent per g of dry weight (µmol TE/g DW).

In vivo anti-diabetic activity

Animals: Adult male Wistar rats (200 - 230 g) were purchased from PIA (Pasteur Institute of Algeria). The animals were then housed in plastic cages and maintained under typical environmental conditions of temperature (22 ± 2°C), 40% relative humidity, and a routine light/dark cycle of 10 h/14 h. Rats were fed a standard diet with free access to water. All experimental procedures involving animals in this study were conducted following the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 2011), and complied with the animal housing and welfare standards outlined in the ARRIVE guidelines 2.0 (Percie du Sert et al., 2020). The research protocol was approved (AP2022/12) by the Research Ethics Committee of Adrar University (Algeria).

Induction of experimental diabetes mellitus: After an acclimatization period of 1 week, diabetes was developed in overnight fasted rats by single intraperitoneal (i/p) injections of 60 mg/kg of STZ freshly dissolved in a 0.1 M sodium citrate buffer (pH 4.5) solution. Moreover, glucose solution (20%) was orally administered to the groups with STZ in order to avoid STZ-induced hypoglycemic mortality (Furman, 2021). Additionally, the control group was intraperitoneally injected with citrate buffer. Fasting blood glucose (FBG) levels were determined 72 hours post-STZ injection via the tail prick method utilizing a Blood Glucose Monitoring Kit (BIONIME, Rightest® GM550, Germany), and the animals with FBG levels ≥ 250 mg/dL were classified as diabetic and selected for the study (Radenković et al., 2016).

Selection of doses: For assessment of the antidiabetic activity in experimental animals, doses of PHF-based diets (i.e., PHFD, 25% and 50%) and infusion extracts (i.e., PHFI, 0.5% and 1%) were selected based on previous pharmacological studies employing plant-based dietary and infusion regimens in rodent models (Nani et al., 2011; Aboura et al., 2017; Olawole et al., 2018; Alzahrani et al., 2022). For both doses, two distinct concentration levels, moderate and higher doses, were chosen to enable evaluation of the antidiabetic efficacy of PHF in a dose-dependent manner.

Experimental design: Thirty male Wistar rats were randomly divided into six groups with five animals (n = 5) using a completely randomized design (CRD), and given the following treatments orally for 4 weeks:

Group 1: Normal Control (NC): Rats received a standard diet and tap water.

Group 2: STZ-Diabetic Control (DC): Rats received a standard diet and tap water.

Group 3: STZ-Diabetic rats treated with 0.5% PHF infusion (PHFI, 0.5%).

Group 4: STZ-Diabetic rats treated with 1% PHF infusion (PHFI, 1%).

Group 5: STZ-Diabetic rats received a diet combined with 25% of PHF (PHFD, 25%).

Group 6: STZ-Diabetic rats received a diet combined with 50% PHF (PHFD, 50%).

The rats' fasting blood glucose levels and body weight were tracked throughout the experiment on days 0, 7, 14, 21, and 28, over four consecutive weeks.

Blood and organs sampling: Following the 28-day experimental period and after overnight fasting, all rats were anesthetized with a single intraperitoneal injection of 40 mg/kg of Zoletil (zolazepam + tiletamine, 1:1), freshly dissolved in phosphate-buffered saline (PBS). Blood samples were directly collected in plain tubes by cardiac puncture. Afterwards, the collected blood was centrifuged for 15 minutes at 3000 rpm to obtain serum for further biochemical analysis. Also, body organs (kidneys, pancreas, liver, and heart) were collected and weighed.

Biochemical parameters: Different biochemical markers, including uric acid, creatinine, urea, triglyceride (TG), high-density lipoprotein (HDL), total cholesterol (TC), low-density lipoprotein (LDL), total protein (TP), alkaline phosphatase (ALP), alanine aminotransferase (ALT), and aspartate aminotransferase (AST) were estimated in serum using commercially available test kits. In addition, serum corticosterone was analyzed using a commercial ELISA kit (Enzo Life Sciences, Catalog No. ADI-900-097) according to the manufacturer’s standardized protocol.

Molecular docking: The molecular docking study was conducted to investigate the plausible mechanism by which PHF reduces hyperglycemia. Briefly, crystallographic structures of four selected diabetes-related proteins were chosen as targets: 5’-adenosine monophosphate protein kinase (AMPK, PDB ID: 6B1U), liver kinase B1 (LKB1, PDB ID: 2WTK), carbohydrate response element-binding protein (ChREBP, PDB ID: 8BTQ), and TBC1 domain family member 1 (TBC1D1, PDB ID: 3QYE). These structures were retrieved from the Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) as PDB files. Following retrieval, water molecules and other heteroatoms were removed from each structure to optimize and stabilize the proteins. Subsequently, polar hydrogen atoms and Kollman charges were added. The prepared proteins were then docked using AutoDock Tools 1.5.7 (ADT) (Morris et al., 2009).

 p-Coumaric acid (p-CA, 3-[4-hydroxyphenyl]-2-propenoic acid), a bioactive compound (PubChem CID: 11790) was used as the ligand for molecular docking study. While metformin, a standard antidiabetic drug (PubChem CID: 4091), served as the comparative ligand. The 3D structures of both ligands were downloaded from the PubChem database (http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov) in SDF format and converted to PDB format using OpenBabel v3.1.1. Hydrogen atoms were added, Gasteiger charges assigned, and root and rotatable bonds detected using ADT. The ligands were then saved in PDBQT format. Grid box coordinates were generated in Discovery Studio, referencing those of the co-crystallized ligand.

 Molecular docking was conducted using AutoDock Vina v1.1.2 (Trott and Olson, 2010). Docked poses were ranked by binding affinity (kcal/mol), and the pose with the lowest binding energy was chosen for further study. BIOVIA Discovery Studio Visualizer 2021 was used to visually assess the molecular interactions of the top-docked poses within the binding sites of the selected proteins. Binding energies and interactions were compared to those of metformin.

Statistical analysis: In our study, statistical data analyses were done using GraphPad Prism software 8.0.1 (GraphPad Software, Inc., USA). ANOVA-test (One-way analysis of variance) followed by Tukey’s post-hoc multiple comparison test was conducted for comparison between the groups, with P < 0.05 regarded as statistically significant. Experimental results were reported as means ± SEM.

RESULTS

Phytochemical analysis: Based on the initial dried plant material, the PHF aqueous extract yield 25% (w/w). Preliminary phytochemical analysis detected the existence of several components, including flavonoids, polyphenols, tannins, steroids, terpenoids, and saponins. In contrast, alkaloids and cardiac glycosides were not detected in the PHF.

 Condensed tannins, total flavonoids, and total phenolic contents (CTC, TFC, and TPC, respectively) in PHF extract were assessed using the calibration curve of catechin (R² = 0.994), catechin (R² = 0.997), and gallic acid (R² = 0.996), respectively. Results showed an interesting TPC in PHF, estimated at 1.43 ± 0.03 mg GAE/g DW. More than 60% of the assessed TPC comprises flavonoids, with an amount of 0.82 ± 0.08 mg CE/g DW. CTC was found to be 0.87 ± 0.04 mg CE/ g DW.

In vitro antioxidant activity

DPPH scavenging capacity: Figure 1A displays the DPPH free radical scavenging capacity (% inhibition) of the PHF extract. Our results revealed that the PHF aqueous extract exerted a high DPPH scavenging activity, as indicated by an IC50 of 0.025 ± 0.002 mg/mL. This value was higher than that of ascorbic acid (0.072 ± 0.002 mg/mL) and comparable to that of gallic acid (0.021 ± 0.003 mg/mL).

DPPH scavenging kinetics: The reaction kinetics of DPPH inhibition were conducted to assess the time-dependent behavior of scavenging activity of the PHF extract toward the free radical. Figure 1B illustrates the evolution of the DPPH inhibition by PHF extract compared to standard antioxidants (ascorbic and gallic acids) during a 20-minute incubation period. The results demonstrated that gallic acid exhibited extremely rapid antiradical kinetics; thus, the reaction achieved a steady state within 5 minutes. PHF extract exhibited an intermediate kinetic behavior similar to that of ascorbic acid within the first ten minutes. PHF extract appeared to be more efficient than ascorbic acid over the remaining time.

Fig 1. DPPH radical inhibitory activity (A) and the reaction kinetics (B) of the PHF extract and standard reference antioxidants. Values are means ± SEM of three replicate tests. PHF, polyherbal formulation; SEM, standard error of the mean.

Ferric reducing-antioxidant power (FRAP): The reducing ability analyzes the potential ability of a natural antioxidant to convert the ferric ions to ferrous ions by transferring a singlet electron. The reducing capacity of the PHF extract was determined using the calibration curve for Trolox (R² = 0.997). Our results demonstrate that the PHF extract displayed a reducing antioxidant power of 3.914 ± 0.115 µmoles TE/100 g DW (Table 2). These findings revealed that the PHF extract exhibits a strong capacity for reducing iron ions.

ABTS radical scavenging activity: The ABTS assay evaluates an antioxidant's ability to neutralize the ABTS free radical by transferring electrons or protons. Table 2 demonstrates that the PHF extract displayed an antioxidant capacity of 4.749 ± 0.069 µmol TE/100 g DW.

Table 2. Antioxidant activities of the PHF as determined via IC₅₀^DPPH, FRAP, and ABTS tests.

Data are expressed as means ± SEM of three replicate tests. PHF, polyherbal formulation; SEM, standard error of the mean.

 In vivo antidiabetic activity

Effect of PHF on fasting blood glucose levels: After 72 hours of diabetes induction, rats had FBG > 250 mg/dL associated with polydipsia, polyphagia, and polyuria. Table 3 displays the FBG levels of normal control, diabetic control, and other experimental groups that received treatment for 28 days. Throughout the experimental period (4 weeks), the diabetic control group exhibited a significant elevation (P < 0.05) in FBG compared to the normal control group. Meanwhile, a substantial decrease in the level of FBG (P < 0.05) was noticed on days 7, 14, and 21 following the administration of a PHF diet at 25% and 50% to diabetic rats in groups 5 and 6, respectively, resulting in normalized FBG by day 28 compared to the diabetic control group. However, in diabetic rats treated with 1% PHF infusion, the significant reduction in FBG (P < 0.05) was not noticed until the 21^st day. Conversely, diabetic rats given 0.5% PHF infusion showed a non-significant decrease in FBG levels throughout the study (P > 0.05). These results indicate that the PHF extract has a dose-dependent response, with higher concentrations being more effective in lowering FBG levels in diabetic rats. The PHF diets appeared to be the most effective in lowering blood glucose levels compared to the PHF infusions. This result is evidenced by a 78.7% (P < 0.001) reduction in FBG levels on the 28^th day compared to the initial FBG levels before treatment initiation (Table 3).

Table 3. Effect of PHF on fasting blood glucose levels (mg/dL).

Values are expressed as means ± SEM (n = 5 rats per group). Different superscript letters within the same column indicate statistically significant differences between groups (P < 0.05, one-way ANOVA followed by post-hoc test). PHFD, polyherbal formulation diet; PHFI, polyherbal formulation infusion; SEM, standard error of the mean.

Effect of PHF on serum corticosterone levels: As illustrated in Figure 2, the diabetic control group exhibited a significant increment (P < 0.05) in corticosterone levels compared to the normal control group. Interestingly, except for the diabetic group receiving a 0.5% PHF infusion (PHFI, 0.5%), all other groups exhibited a marked reduction in serum corticosterone (P < 0.05) as compared to the diabetic control group.

Fig 2. Fasting blood glucose and serum corticosterone levels on the 28^th day. Values are means ± SEM (n = 5). Bars marked with different superscript letters exhibit significant differences (P < 0.05). SEM, standard error of the mean; DC, diabetic control; NC, normal control; PHFD, polyherbal formulation diet; PHFI, polyherbal formulation infusion.

Effect of PHF on body weight: As shown in Figure 3 (A), there was a marked reduction (P < 0.05) in body weight in diabetic rats as compared to the normal control group on the 7^th day following the induction of diabetes (STZ). In addition, the diabetic control group showed a statistically significant (P < 0.05) decrease in body weight during the experiment compared to their initial body weight, with a weight loss of 10% by the 28^th day. Nevertheless, administration of PHFI (1%), PHFD (25%), and PHFD (50%) to diabetic rats resulted in a marked increase in body weight as compared to the diabetic control group, with weight gains of 4.48%, 6.22%, and 8.46%, respectively. However, administration of PHFI with 0.5% to diabetic rats resulted in a slight rise in their body weight, with a weight gain of 0.59% by day 28 (Fig. 3B). The body weight rise in the groups receiving PHF diets was statistically more significant (P < 0.01) than in the groups receiving PHF infusions.

Fig 3. (A) Weekly records of body weight (g) and (B) weight change (%) of control and diabetic rats treated with PHF. Values are means ± SEM (n = 5). Curves with different superscript letters on the 28^th day exhibit significant differences (P < 0.05). SEM, standard error of the mean; DC, diabetic control; NC, normal control; PHFD, polyherbal formulation diet; PHFI, polyherbal formulation infusion.

Effect of PHF on the relative pancreas, kidney, heart, and liver weights: Relative organ weights (ROW) were determined by collecting and weighing the pancreas, kidney, liver, and heart following 28 days of treatment. As illustrated in Figure 4, there were no statistically significant (P > 0.05) changes in the relative weight of the pancreas (RPW) and heart (RHW) across all experimental groups. However, the diabetic control group exhibited statistically significant (P < 0.05) increases in relative kidney and liver weights (RKW and RLW, respectively) compared to the normal control group. On the other hand, the administration of PHFI (1%) or PHFDs (25% and 50%) significantly decreased (P < 0.05) the RLW and RKW, with the most substantial effect (P < 0.01) exhibited by PHFDs.

Fig 4. Relative organ weights of normal and diabetic rats. Values are means ± SEM (n = 5). Bars with different superscript letters for each organ exhibit significant differences (P < 0.05). SEM, standard error of the mean; DC, diabetic control; NC, normal control; PHFD, polyherbal formulation diet; PHFI, polyherbal formulation infusion.

Effect of PHF on serum lipid profile: As displayed in Figure 5, the diabetic control group exhibited a statistically significant increase (P <0.05) in triglycerides (TG), low-density lipoproteins (LDL), and total cholesterol (TC) levels concomitant with a substantial reduction (P <0.05) in high-density lipoproteins (HDL) concentrations versus normal control group. Meanwhile, diabetic animals that received PHFD (25%), PHFD (50%), and PHFI (1%) exhibited a significant decrease in LDL, TG, and TC levels (P < 0.05), accompanied by a considerable increase in HDL levels, compared to the diabetic control group. Interestingly, PHFDs (25% and 50%) have demonstrated the most significant (P < 0.01) improvements in lipid profiles as compared to the PHFI (1%).

Fig 5. Effect of PHF on lipid profile of control and diabetic rats treated with PHF. Values are means ± SEM (n = 5). Bars with different superscript letters for each organ exhibit significant differences (P < 0.05). SEM, standard error of the mean; DC, diabetic control; NC, normal control; PHFD, polyherbal formulation diet; PHFI, polyherbal formulation infusion; HDL, high-density lipoprotein; TC, total cholesterol; TG, triglycerides; LDL, low-density lipoprotein.

Effect of PHF on hepatic biomarker enzymes and total protein: Table 4 displays the serum hepatic biomarkers, namely aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), and alkaline phosphatase (ALP), as well as total protein levels in both control and treated animals. The results indicated that STZ-induced diabetes caused a marked (P < 0.05) elevation in serum levels of ALP, ALT, and AST enzymes while also lowering the TP levels. Moreover, diabetic animals that were treated for 28 days with PHF extract (1%), PHF diet (25%), and PHF diet (50%) showed significant (P < 0.05) reductions in ALP, ALT, and AST levels compared to the diabetic control group. Meanwhile, there was a marked increase (P < 0.05) in TP levels in the diabetic groups receiving PHF infusion (1%) and PHF diets (25% and 50%) compared to the diabetic control group. On the other hand, diabetic rats that received a 0.5% PHF infusion did not exhibit any significant improvement in liver enzyme activities or total protein levels. Interestingly, compared to the PHF infusions, the PHF diets appear to be most effective (P < 0.01) in improving total protein and hepatic biomarker enzyme levels.

Table 4. Effect of PHF on some hepatic biomarkers and total protein in treated diabetic and control rats.

Values are expressed as means ± SEM (n = 5 rats per group). Different superscript letters within the same column indicate statistically significant differences between groups (P < 0.05, one-way ANOVA followed by post-hoc test). PHFD, polyherbal formulation diet; PHFI, polyherbal formulation infusion; ALP, alkaline phosphatase; ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase; SEM, standard error of the mean.

Effect of PHF on kidney function biomarkers: Table 5 displays the serum values of kidney biomarkers, namely creatinine, uric acid, and urea, across all experimental groups. The diabetic control group exhibited a marked (P < 0.05) elevation in the assessed serum kidney biomarker levels compared to the normal control group. Moreover, except for the PHF infusion (0.5%) group, significant improvements (P < 0.05) in serum kidney biomarker levels were observed in all other PHF-treated groups, with PHF diets appearing to be more effective (P < 0.01) in improving kidney biomarkers than PHF infusion.

 Table 5. Effect of polyherbal formulation on some kidney function parameters in normal and STZ-induced diabetic rats, after 28 days of treatment.

Values are expressed as means ± SEM (n = 5 rats per group). Different superscript letters within the same column indicate statistically significant differences between groups (P < 0.05, one-way ANOVA followed by post-hoc test). PHFD, polyherbal formulation diet; PHFI, polyherbal formulation infusion; SEM, standard error of the mean.

Potential interaction of p-CA with target proteins: Molecular docking analysis was performed to elucidate molecular interactions and binding affinities between the selected compound and the four target proteins. The results of molecular docking focused on binding affinity values (kcal/mol), with more negative values indicating stronger and more stable ligand-protein interactions. The results of free binding energies and types of interactions that occur of p-CA and standard metformin at four targeted protein’s active sites are summarized in Table 6. Analysis of the docking results reveals that p-CA exhibits superior binding affinities and interactions against target proteins compared to standard metformin.

Table 6. Binding energy values and summary of the protein‒ligand interactions at the binding site of the proteins.

The interactions between the ligands and target proteins are illustrated in the 2D and 3D representations displayed in Fig. 6. The significant binding affinity of p-CA is further substantiated by the 2D diagrams of docking results, which illustrates that p-CA establishes more interactions with the target proteins when compared to metformin (Fig. 7).

Fig 6. 3D and 2D visualizations of molecular interactions between p-CA and target proteins. Each panel displays the 3D structure (left) and 2D interaction diagram (right) for (A) AMPK, (B) LKB1, (C) ChREBP, and (D) TBC1D1. 

Fig 7. 2D visualization of molecular interactions between metformin and (A) AMPK, (B) LKB1, (C) ChREBP, and (D) TBC1D1 target proteins.